Peptide mapping 서열 분석 및 응용

1. 개요

단백질과 같은 생체 고분자의 특징을 가진 분자적 특징은 현재까지 intact form 을 유지한 조건에서 단백질에 대한 서열을 확인하는 방법은 부분 N말단 서열을 확인하는 edman degradation method 이외에는 대체 분석법이 없는게 현재 추세이며 따라서 단백질의 서열을 효과적으로 분석해낼 수 있는 방법은 그 단백질의 peptide 로 저분자화 시키는 전처리과정을 통해 얻어진 total peptide 시료를 질량 분석 장비나 LC(HPLC, UHPLC,nanoLC) 크로마토그래피 분석 장비를 이용하여 효율적인 분리가 되는 조건하에서 각 분석장비의 검출기(detector)로 부터 검출된 peptide 마다 fingerprinting 특이값의 해석을 통해 유전자가 암호화한 서열과의 동질성 내지 같은 유전자로 발현된 reference protein (표준단백질)과의 비교 동질성의 입증을 통해 단백질의 1차 서열의 재현성을 검증하는 분석법이다.

현재까지도 단백질의 광범위한 서열범위를 해석할 때나 제한된 시료 조건에서 unknown protein 을 동정(identification) 하기 위해서는 지금과 같은 peptide mapping 서열 분석방법을 토대로 적용하여 분석하게 된다.

 

2. 분석 장비

1)HPLC(UHPLC)-UV(PDA, DAD)

크로마토그래피의 분리능과 peptide 가 가지는 UV 동일 선택적 파장에 대한 흡광 반응의 특징을 이용하여 분석을 진행할 때, 동일 장비 / 용매 조건하에서 재현되는 peptide 고유의 검출 시간 (RT : retention time, RRT : relative retention time) 값을 근거로 peptide 의 fingerprinting 특이 값으로 설정하는 조건이므로 보통은 지속적이고 재현성 있는 대량의 단백질을 생산하고 각 batch 별 동일한 단백질의 특성 조건일 때 reference 가 되는 단백질과 동일 시점에 비교 확인 시험을 통해 peptide 의 fingerprinting 특이 값이 두 시료간 동등성의 입증을 통해 단백질의 서열 동질성을 입증하는 방법이다. 따라서 본 시험은 근거 기준 값을 제시할 수 있는 표준 단백질(reference protein) 과의 비교 시험 조건이 아닌 경우 진행해서는 않되는 점이 가장 중요하다.

 

2) MALDI-TOF

질량분석기 중 매트릭스보조 레이저 탈착 이온화(Matrix assisted laser desorption ionization)에 TOF(time of flight)라는 이온 비행 시간차 질량 검출기의 조합으로 분석을 진행하는 장비로써 본 분석장비의 데이터는 MS ion 의 모니터링 질량값 범위 내 mass spectrum 의 데이터 형식으로 기록되는 특징이 있는 장비이다. 그리고 MALDI 이온화 방식은 soft ionization 방법 중 한가지로 단백질/펩티드 분자가 안정적으로 유지한 상태에서 미량의 조건에서도 충분히 데이터 시그널의 이온화 이후에 검출되고 이때 peptide 는 전하(charge ; n) 는 +1 의 양이온으로 안정적으로 이온화되는 특징이 있으며 TOF 질량 검출기는 최소 50m/z 에서 최대 5,000m/z 정도의 질량값 범위 내의 모든 peptide 를 일괄적으로 mass ion 을 검출하여 하나의 mass spectral data 로 기록할 수 있다. 본 장비의 장점으로는 MALDI 이온화가 soft-ionization 중 가장 강력한 에너지의 이온화 방법이므로 silver staining 통해 확인된 ng 수준 정도의 단백질에 대한 미량의 단백질에서 부터 가수분해를 통해 유리된 peptide 의 공유 질량 값에 대한 peptide fingerprinting 값을 얻을 수 있다. 단, unknown protein ID 분석에서는 극단적인 미량 단백질의 경우 peptide mass fingerprinting 값의 수가 적게 얻어지는 경우 정확한 protein ID 결과를 도출할 수 없거나 고도로 혼합된 단백질 시료로 부터 얻어진 다양한 peptide mixture 조건에서는 마찬가지로 정확한 protein ID 결과를 얻지 못할 수도 있다.  본 분석은 마찬가지로 서열확인을 목적으로 진행하는 경우 동일시점에 시료 전처리를 시작으로 이미 서열 결과 기준값이 peptide mass fingerprinting 값과 상응하는 값이 설정이 된 reference protein 과 비교 확인 시험을 통해 서열을 상동성을 입증할 수 있다. 단, 시료 전 처리 과정 중 인위적인 일탈에 의해 miss-cleavage 가 다르게 발생하거나 protease activity 가 서로 다른 protease 를 사용하는 경우 peptide mass fingerprinting 값이 다른 peptide 가 얻어질 수 있으며 MALDI 이온화 시료를 steel plate 에 spotting 하기 전 충분히 desalting 이 되어 있지 않은 경우 염의 간섭 이온인 adduct ion 발생으로 데이터 해석에 혼선이 올 수 있다. 그리고 미량의 단백질에 대한 protein ID 분석 진행 시 시료 내 포함된 염의 간섭은 감도는 감소시키는 직접적인 분석 영향을 미치기도 한다. 이때 ZipTip C18 과 같은 소모품을 이용하여 MALDI spotting 직전에 시료를 desalting 을 꼭 수행하여야 한다.

 

3) LC(HPLC, UPLC, nanoLC)-MS / 액체 질량 분석기

고분리능 크로마토그래피 장치와 C18 컬럼에서 극성/비극성 간 높은 분리도를 이용하여 1차 분리 후 tandem MS 검출기 (tandem quadrupole,  quadrupole-TOF) 의 고해상도 이온 분리능을 이용하여 peptide 의 고도의 분리 조건 및 고감도 검출조건을 효과적으로 단백질에 대한 peptide mapping 을 수행할 수 있는 분석 장비로 본 장비를 이용한 분석의 응용범위는 MALDI-TOF 질량분석 장비와 비교하여 월등히 넓게 적용될 수 있다.

우선 본 장비는 LC 를 통한 1차 peptide 검출 시간에 대한 fingerprinting 뿐만이 아니라 2차로 tandem MS 가 가지는 1차 MS 검출기에서 분리된 MS ion 에 대한 fingerprinting 값 그리고 2차로 1차로 검증된 peptide MS fingerprinting 으로 부터 얻어진 MS/MS  값을 통한 직접적인 서열 확인 값을 동시에 획득이 가능하다는 장점이 있다. 또한 액상의 조건으로 LC 내 역상 C18 컬럼을 통과하여 순차적으로 들어간 peptide 는 ESI (Electro spray ionization : 전자 분무 이온화)에 의해 전하(charge ; n) 는 peptide 의 분자량이 증가되는 것과 비례하여 여러 다중 전하(multiple charged ion)으로 동시에 MS ion 이 검출되어 그 중 보다 신뢰할 수 있는 데이터를 사용할 수 있게 된다. 또한 이들 다중 전하 이온 가운데 MS/MS 가 trigger 가 된 MS/MS 데이터를 이용하여 단백질내 특정 가수분해 이후 예상할 수 있는 peptide 영역에 대한 sequencing 분석 또한 가능하게 한다.

따라서, 본 질량 분석장비는 표준 단백질과 함께 동시에 비교 확인 시험을 진행하지 않더라도 이런 다양한 peptide 별 검출 특이값을 해석을 통해 예상 아미노산 서열과의 서열 동질성을 입증할 수 있게 된다. 또한, LC 를 통해 시료가 주입되므로 경우에 따라서는 보유한 시료를 거의 분석에 그대로 활용할 수도 있다. 만약 미량의 unknown protein 이나 protein 혼합물 시료도 nanoLC 를 이용하면 보다 효율적인 시료 주입 조건을 확보하여 분석을 진행할 수 있다. 또한 크로마토그래피 기초 데이터를 획득할 수 있으므로 peptide 마다 고유한 정성 뿐만이 아니라 정량적인 해석이 가능한 값으로 활용될 수 있다.

따라서 본 분석 장비의 활용은 단백질의 N/C-terminal sequencing, peptide mapping, full amino acid sequencing disulfide-bond determination, PTM site determination, oxidation stress level 평가, 단백질 상대 정량 분석 등 광범위한 분석 목적을 충족하는데 활용될 수 있다.

 

3. Peptide mapping 분석 과정 (LC-MS)

 

1) 시료 전 처리

단백질을 peptide mapping 분석을 통해 분석을 위하여 시료 전처리 과정을 알아보면

1차 서열 확인을 위한 목적인 경우 액상의 단백질을 필요에 따라 선택적인 농축/침전을 통해 액상 시료 내 단백질만 선택적으로 회수한 후 재용해 후 특정 아미노산과 아미노산 위치 별 절단 특이성을 가지는 protease 를 이용하여 가수분해 반응을 진행하고 그 다음 단백질의 공유 결합을 끊어내어 단백질간 oligomer 형태를 비가역적으로 monomer 형태로 전환하는 unfolding 전처리를 한 후 마지막으로 desalting 과정과 speed Vac 장치를 이용한 농축을 통해 적절히 농축된 시료를 준비한다.

만약 액상의 희석된 단백질 조건에 농축/침전 또한 버퍼의 특정 첨가제 성분으로 protease 가수분해 반응이 어려울 경우에는 단백질 전기영동을 이용한 in-gel 또는 membrane blotting 을 통해 on-membrane 상태의 시료를 준비하여 앞서 언급한 시료 전 처리 과정을 수행하여 가수분해된 peptide 혼합물 시료를 시료 분석목적에 맞게 적절하게 준비하도록 한다.

Peptide mapping 분석에 적합한 protease 종류

단백질 시료 유형 별 전처리 과정

2) LC-MS 기초 분석

우선, 준비된 시료를 분석하기 앞서 Mass 검출기의 교정(calibration)을 수행하여 시료 내 peptide 의 질량 검출값에 대한 이론값과 실측값이 일정 범위 이상 어긋나지 않게 교정과정을 꼭 수행해주어야 한다. 이 과정을 생략하는 경우 mass 측정값이 일정 질량값 수준이상 부터 어긋나게 되며 따라서 peptide fingerprinting MS 값, MS/MS sequencing 모두 올바르게 해석되지 않을 수 있다.

Calibration 과정이 적절히 완료된 장비에 시료를 주입하여 raw data 를 기록하며 이때 raw data 는 LC-MS 를 조합하고 장비 설정값에 따라 검출기별로 값이 기록되게 된다. 참고로 LC-MS 에서 peptide mapping 과정을 수행할 때 이동상에는 0.1~0.2% v/v 포름산(formic acid)가 포함되어 있는데 이는 positive ionization 을 도와 주기 위한 용매 첨가제 이나 UV 흡광 값을 상대적으로 억제할 수 도 있다. 따라서 UV 흡광 검출값으로 chromatogram 데이터를 함께 얻고자 한다면  formic acid 대신 TFA(trifluoro acetic acid) 를 이용하기를 권장하며 Mass 검출과 동시 검출을 가급적 피할 것을 권장한다.

 

3) MS/MS 해석 tool 을 이용한 데이터 해석

질량분석기 장비와 함께 제공된 MS/MS 해석 tool 을 이용하여 raw mass data 내의 다양한 MS/MS 데이터를 해석해 낼 수 있다. 이때 가장 중요한 정보가 데이터 해석의 기초 backbone 이 되는 아미노산 서열 정보가 정확하게 입력이 되어야 하며 이때 부정확하게 입력된 예상 아미노산 서열 정보로 인하여 데이터 해석이 잘못된 방향으로 결과를 도출해낼 수 있다. 그리고 실제 사용한 protease 와 동일 enzyme parameter 를 설정해야 한다. 만약 단백질을 가수분해시 사용한 protease 와 다른 protease 를 입력하여 데이터 해석을 진행하는 경우 peptide fingerprinting MS 이론값과 MS/MS 이론값이 설정한 protease 기준으로 산출되므로 실제 peptide 의 측정 MS, MS/MS 값이 서로 간에 matching 이 되지 않게 된다. Protease miss-cleavage 값을 일정 수준 반영을 하여 실제 protease 전처리 시 full digestion 이 일어나지 않은 경우를 대비하여 효과적인 MS, MS/MS 데이터 해석이 진행될 수 있도록 한다.

 

4) 분석 목적에 따른 데이터 정리

N/C-terminal sequencing, peptide mapping, full amino acid sequencing disulfide-bond determination, PTM site determination, oxidation stress level 평가 등 분석목적에 맞게 데이터를 정리하여 reporting 을 하도록 한다.

 

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