Edman degradation method (에드만 분해법)

1. 개요

에드만 분해법(Edman degradation)은 펩타이드/단백질의 아미노산 서열을 분석하는 방법 중 하나로 N말단 첫 번째 아미노산 부터 C말단 방향으로 순차적인 아미노산 유도체와 유리를 통해 얻어진 유리 아미노산을 확인하고 일련의 반응을 반복적으로 수행하여 얻어진 아미노산 식별 데이터를 조합하여 확인하는 N말단 서열 분석법으로 잘 알려져 있다.

현재는 자동화된 에드만 분해법 protein sequencer 장비로 구현되어 다양한 단백질의 N말단 부분서열 확인을 위한 목적으로 많이 활용되고 있다.

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2. 반응

1) PITC coupling 반응

첫 번째 과정인 연결에서는 페닐이소티오시아네이트(phenylisothiocyanate, PITC)가 단백질의 N말단 첫 번째 위치한 아미노산의 free-NH2 의 화학그룹과 공유 결합을 통해연결이 되는 반응으로 이 단계에서 coupling 이 될수 없는 구조적인 변형 아미노산이 위치하는 경우에는 일련의 유도체 및 유리 반응이 일어날 수 없어 PTH(Phenylthiohydantoin)-AA 형태로 전환되어 검출되는 시그널을 확인할 수 없다

PITC coupling 이 불가능한 아미노산 변형체 : pyroglutamate, acetylated amino acid acylated amino acid, PEG conjugated amino acid, lipid conjugated amino acid

2) Cleavage 반응

PITC coupling 된 첫번째 아미노산과 그 다음 아미노산 간 peptide bond (CO:NH) 사이를 특이적으로 절단하기 위하여 100% TFA(trifluoroacetic acid) 를 통해 유리되고 이때 유리된 아미노산은 중간 유도체인 ATZ(anilinothiazolinone)-amino acid 형태로 바뀐다. 이때 이러한 강산과 유기용매의 반응에 따라 단백질의 부분 분해과정이 일어날 수 있으므로 남아있는 단백질은 ethy acetate, 1-chlorobutane 의 용매로 세척을 반복적으로 진행하여 pH 를 중화과정을 통해 안정화 시키고 유리된 ATZ-amino acid 는 다음의 반응을 위해 converter flask 로 transfer 를 한다.

3) Conversion 반응

converter flask 로 옮겨진 ATZ-amino acid 는 25% TFA 용제를 이용하여 PTH-amino acid 로 전환하고 건조 및 농축, 재용해를 거쳐 PTH C18 컬럼에 주입하여 얻어진 아미노산의 특이적 검출 시간(elution time) 을 표준 PTH-amino acid 의 검출 시간과 비교하여 아미노산을 식별해낼 수 있다.

4) 연속적인 cycling 반응

PITC coupling 반응과 cleavage 반응 그리고 conversion 반응을 후, PVDF filter 상에 남은 단백질은 edman 의 일련의 반응을 cycling 반응으로 진행을 하면 매 cycle 마다 N말단의 첫번째 아미노산 부터 순차적인 아미노산의 데이터를 획득할 수 있고 분석을 희망하는 N말단 잔기수를 조정하여 분석을 진행할 수 있게 된다.

3. Edman sequencing 분석의 필요성

최근에 들어 Edman sequencing 분석법을 대체할 수 있는 분석이 bottom-up 방식으로 접근하는 LC-MS(액체질량분석기) 또는 MALDI-TOF를 이용하여 peptide mapping 분석법으로 접근하여 N말단 서열 영역에 해당하는 peptide 에 대한 sequencing 분석법이 사용 중이나 그럼에도 불구하고 여전히 edman sequencing 분석법이 단백질 서열 분석 시험법에 대체로 광범위한 목적을 해결하기 위해 사용 중인 몇 가지 이유를 살펴보고자 한다.

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1) 천연의 미지(unknown) 단백질 screening 을 위해

질량분석을 이용한 N말단 서열분석은 미량의 단백질에 대한 서열 정보를 부분 또는 전체를 커버하여 얻을 수 있다는 장점이 있다. 여전히 full amino acid sequencing 에서는 대체할 수 있는 방법은 없다. 그럼에도 불구하고 본 분석진행을 위해서는 대체적으로 예상 아미노산 서열 정보가 참고 정보로 필수라는 점에 있다. 만약 천연의 조건에서 실험 목적과 조건에 의해 unknown protein 이 확인되었다면 대부분은 질량 분석을 이용한 protein ID 분석을 통해 protein 을 식별하는 경우가 많다. 하지만 만약 unknown protein 이 유래된 생물종의 아미노산 서열 DB 에 해당 단백질 서열 정보가 포함되어 있지 않다면 정확한 protein ID 정보를 얻지 못하는 경우가 종종 있다.

이때, blind sequencing 이 가능한 edman sequencing 분석을 수행하여 얻어진 10mer 이상의 서열 정보가 확인이 가능하다면 이 정보를 바탕으로 어떤 단백질 type 인지 확인이 가능하며 앞서 수행한 protein ID 분석 결과와 상호 보완하여 결과를 업데이트 할 수 있게 된다.

또한 이 정보를 바탕으로 southern blot DNA screening 인 5`-RACE PCR 등에 활용할 수 있는 primer 를 design 및 합성에 가장 기초 정보로 활용할 수 있다.

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2) 빠른 데이터 분석을 위해

질량 분석은 고감도/고해상도 조건으로 획득한 데이터를 통해 서열 분석이 이루어 지는데 이러한 과정까지 진행하기 위해서는 시료 전처리라는 사전과정이 필수적으로 필요로 한다. 그리고 reference sequence 정보의 검토 후 분석 프로그램이 데이터를 해석하는데 시간이 다소 소요될 수 있다. 특히 unknown protein 인 경우에는 sequence library 를 이용하여 분석하므로 몇 일 이상의 시간이 필요로 하게 된다. 반면, Edman sequencing 분석의 경우 대게 하나의 시료 당 하루 안에 raw data 및 데이터 분석이 가능하다는 장점이 있다. 따라서 짧은 N말단 서열 분석을 진행이 계획된 경우라면 edman sequencing 방법을 추천하고자 한다. 특히, 재조합 단백질의 최종 발현을 판정함에 있어서도 신속한 분석 결과를 얻을 수 있다.

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3) 단백질이 fragment 변화가 관찰될 때

의도에 의한 조건이나 의도하지 않은 조건에서 full length protein 으로 부터 단백질이 특정 위치가 절단되어 발생하는 fragment protein 은 다양한 cell line 에서 재조합 조건으로 단백질을 발현/생산하는 조건에서 종종 일어날 수 있는 이벤트로 이때 fragment protein 에 대한 말단 서열을 확인함으로써 앞으로 발현 조건 등을 개선하는데 있어 참고할 정보로 활용될 수 있다는 점이다.

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4) N말단 부가된 서열의 존재 유/무 확인 시

재조합 단백질의 경우 vector 를 design 하는 과정에 조건에 따라서는 부가된 short peptide 를 함께 삽입된 유전자로 설계하여 발현하기도 하고 발현 단백질에 특성 단백질을 conjugation 시키기도 한다. 이런 경우에 N말단 서열 분석을 통해 이들 조건에 충족하는 서열인지 여부를 판단하는 결과로 해석할 수 있는 분석이다.

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5) N말단 서열 다양성 결과를 정성/정량으로 해석을 하고 싶을 때

질량 분석을 이용한 N말단 서열 분석은 고감도 조건의 분석을 수행하므로 N말단 서열 결과가 다양한 변화된 peptide 1차 구조의 결과로 해석될 수 있다. 이때 단백질의 발현 공정을 개선하고 평가하기 위해서는 N말단 서열의 안정적인 서열 확인결과가 안정적으로 단백질이 발현되었는지를 평가하는 지표로 사용된다. 하지만 질량 분석 조건에서는 N말단 서열내 동일 아미노산 위치에서의 chemical 변화에 대한 정량적인 해석은 가능하나 protease 에 의해 일어날 수 있는 processing (분해)에 의한 N말단 서열 다양성은 질량값의 특이성(specificity)가 다른 조건이 되므로 서로 간 상대 정량적인 해석이 불가능하다는 제약이 있다. 그에 반해 edman sequencing 분석은 정량적으로 주입된 표준 PTH-amino acid 혼합 표준물이 주입되어 reference 로 사용되므로 이때의 peak height 및 area 값은 안정적인 정량 기준 값으로 사용되어 질 수 있다. 또한 LC-MS 질량분석 데이터와 같이 유효 함량 값 여부가 판단이 어려운 혼합된 결과라도 edman sequencer 의 경우 PDA 검출기를 이용한 peak signal 로 데이터를 확인하는 조건이므로 purity 검증에 보다 유리한 결과라고 할 수 있다. (참고로 protein purity 검증을 chromatography 조건으로 수행 시 광학 검출기(UV or PDA(DAD))조건에서 수행하는 점이 이를 뒷받침한다.

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4. Edman sequencing 분석 진행 전 유의 사항

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1) 분석을 위해서는 PVDF membrane 에 고정화(immobilization) 된 단백질 조건이어야 한다.

Edman sequencing 에서의 반응은 다양한 유기 용매와 강산 시약을 반응에 적절하게 단백질 시료와 일정 시간 반응을 시켜야 한다. 이때 액상 그대로인 경우 이러한 일련의 반응 과정 중 단백질이 wash-out 되므로 시료는 항상 chemical resistance 한 재질의 support 에 고정화가 되어 있어야 하며, 다른 방법은 glass fiber filter 에 polybrene 을 전처리한 후 단백질을 고정화 시키는 방법이 있다. 그 외 다른 재질의 membrane 을 사용해서는 안된다. 이런 경우 edman 시약과 반응에 의해 불안정하게 부산물이 생성되어 간섭이 되거나 protein sequencer 의 고장의 원인이 된다.

(특히, nitrocellulose 또는 PVDF 와 혼합 재질은 사용해서는 안된다.)

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2) 단백질 순도에 따라 분석을 의뢰하는 시료 조건이 달라진다.

순도가 높은 정제 단백질/peptide 는 액상 그대로 분석기관에 분석을 의뢰하면 되고 이때 dot-blot 방식으로 단백질을 고정화 시킨 후 분석이 진행되며 다른 단백질과 혼합된 경우 단백질 전기 영동을 수행하여 단백질 간 충분히 분리가 된 조건에서 PVDF membrane 을 사용하여 electro botting 을 수행한 후 membrane 을 단백질 염색 방법과 동일한 시약을 이용하여 짧은 시간 염색 및 탈색 후 membrane 상 단백질 band 만을 회수하여 분석을 의뢰하면 된다.

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3) 간섭/오염을 최소화하는 조건에서 분석이 필요하다.

Edman sequencing 의 화학반응에서 coupling 과 cleavage 반응은 무수화 조건에서 수행되므로 이때 시료 내 간섭/오염 물질의 포함 여부에 따라 비 특이적 edman reaction 에 의해 유발되는 부산물이 데이터에 간섭 peak 로 확인될 수 있다. 따라서, 액상시료는 dot-blot 방식으로 PVDF membrane 에 고정화 시킬 후 충분히 water 로 rinse 를 진행한 후 건조 시킨 뒤 분석을 진행한다. 단백질 전기영동 후 electroblotting 으로 시료를 준비하는 경우 electroblotting 직후에 water를 이용한 membrane rinse 가 충분히 진행하고 2차는 staining/destaining 과정 직후 이들 시약의 잔존물이 membrane 상에 고농도로 남아 있지 않게 2차 rinse 를 해줌으로써 간섭영향을 최소화 할 수 있다.

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4) 합성 펩티드 중 변형아미노산이 첫번째 위치한 경우

Edman reaction 의 가장 중요한 점은 첫 번째 위치한 아미노산이 free-NH2 형태의 일반아미노산 구조인 점이다. 만약 확정적인 예상 아미노산 서열 정보가 그렇지 않은 변형되 아미노산인 경우 본 시험법 대신 LC-MS 와 같은 질량 분석을 이용한 방법으로 접근하는 것이 좋다.

6. PITC coupling blocked amino acid

1) pyroglutamate

2) Acetylated 1st amino acid

3) PEGlyated 1st amino acid

4) Lipid conguated 1st amino acid

 

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